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    神奇的生物素biotin

    发布时间: 2024-03-26  点击次数: 141次

    1. 什么是生物素?

    物素分子量为244.31,分子中有两个环状结构,其中I环为咪唑酮环,是与亲合素结合的主要部位;II环为噻唑环,上有一戊酸侧链,其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的结构。利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物,称为活化生物素,同时可根据特殊的用途对这些试剂的化学性质(溶解性、臂长、可剪切与否)进行优化,以适合与各种生物大分子结合的需要。

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                                                                  生物素

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    2. 什么是生物素化?

    生物素化是指将化学物质或分子与生物素(biotin)结合在一起的过程。生物素是一种水溶性的维生素,也被称为维生素B7或维生素H,它在许多生物体的生物化学过程中发挥着重要作用。生物素可以通过化学合成或从天然来源(如食物中)获得。生物素化通常在生物实验室中用于标记和检测特定的分子或蛋白质,其中生物素与待检测的分子或蛋白质结合,然后可以通过生物素与其他分子之间的特异性相互作用来检测或纯化目标分子。


    3. 什么是生物素-链霉亲和素(SA-Biotin)系统?

    Streptavidin是一种具有四个相同结合位点的蛋白质,它能够与生物素结合形成非常紧密的复合物,也是已知的非共价相互作用之一(解离常数 (Kd) 约为 10x-15 mol/L)。生物素和Streptavidin之间的键形成非常迅速,一旦形成,它不受pH值、温度、有机溶剂和其他变质剂的影响。生物素与Streptavidin之间的结合非常特异,因为它们之间存在着高度亲和力。这种亲和力使得生物素-Streptavidin复合物成为一种非常有用的工具,用于检测、分离和纯化许多生物分子,例如蛋白质、DNA或RNA。生物素与Streptavidin互作通常被用于许多生物学实验中的标记和纯化技术,这种相互作用也被广泛用于结合生物分子(如蛋白质、脂质和核酸)、合成分子(如荧光标记)、生物芯片技术、免疫组化、Western blot分析和其他分子生物学实验中。

    生物素-链霉亲和素系统的一个主要优点是能够提高检测灵敏度。这在很大程度上是由于链霉亲和素的四聚体构象。一种链霉亲和素蛋白能够以高亲和力和选择性结合四种生物素分子。这种多样性能够放大弱信号,并通过简单的工作流程提高哺乳动物细胞或组织中中低丰度目标的检测灵敏度。另一个关键优势是生物素-链霉亲和素系统的多功能性。因为链霉亲和素可以与多种报告标签结合,所以它可以很容易地结合到几乎所有的免疫测定中。例如,链霉亲和素的酶偶联物广泛用于酶联免疫吸附试验 (ELISA),而荧光标记的链霉亲和素,如iFluor 488链霉亲和素,则广泛用于细胞表面标记、荧光细胞分选 (FACS) 和其他荧光检测成像应用。

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    链霉亲和素-生物素标记抗体相互作用的图示

    4. 生物素标签的应用

    在许多蛋白质研究应用中,生物素标记(即生物素化)的蛋白质常规用Streptavidin结合物检测或纯化,包括

    1. 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

    2. 免疫组织化学 (IHC)

    3. Power Styramide 信号放大,是酪胺的替代品

    4. 免疫印迹

    5. 免疫荧光显微镜

    6. 细胞表面标记

    7. 亲和纯化

    8. 荧光细胞分选 (FACS)

    9. 流式细胞术

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    Dynabeads 链霉亲和素相关磁珠的应用

    5. 生物素标记的大致流程:

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    • 待标记物的蛋白浓度不能过低,如若浓度过低需经超滤浓缩等手段提高浓度至0.1mg/mL以上。
    • 一个蛋白质可能被多个生物素标记,标记时,生物素与待标记物应有合适的比例,确保标记后不影响待标记物的活性。推荐生物素:抗原蛋白比例为1~3:1,生物素:抗体比例为5~20:1或根据标记试剂盒说明书推荐比例。
    • 为减少空间位阻影响,基于检测灵敏度特异性等要求,可在生物素与被标记物之间加入交联臂结构。
    • 如果偶联基团为氨基,待标记物的系统不得含有游离的氨基(Tris,氨基酸)、载体蛋白(BSA)或者其他干扰物,若有干扰物需要用标记缓冲液反复超滤确保其去除干净,若采用其他基团偶联试剂,待标记物系统亦不能有含对应的游离基团的物质。
    • 如果待标记物为分子量较小的物质,在纯化过程中注意超滤管、脱盐柱、透析袋的截留分子量。
    • 标记反应后的体积量至少在100μL以上,以达到纯化时的最小上样量。
    • 标记反应完成后(氨基偶联体系),可在体系中加入适量的含游离含氨基小分子物质,中和游离的生物素活化试剂,提高纯化效率,减少后续反应的假阳性和高背景。
    • 纯化后的标记蛋白可采用A280或BCA法测定蛋白含量。
    • 标记纯化后的蛋白可根据蛋白性质进行分装长期保存,减少冻融次数。
    蛋白互作中利用临近连接法用生物素标记互作蛋白
    可通过生物素连接酶(Biotin-protein ligase, BirA)对Avi标签融合蛋白或多肽快捷、高效地进行生物素标记。生物素标记的蛋白可使用基于Streptavidin或Avidin方法进行纯化或检测,例如使用Streptavidin磁珠对生物素标记蛋白进行纯化,或用HRP等标记的Streptavidin对生物素标记蛋白进行检测。Avi标签是由15个氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)组成的短肽标签,在ATP和生物素存在的条件下,BirA在Avi标签的赖氨酸残基上连接一个生物素,从而实现目的蛋白的生物素标记。
    生物素连接酶BirA特异性的生物素标记Avi标签有多方面的优点。Avi标签小且对融合蛋白的影响非常小,只针对Avi标签上的Lys残基进行特定位置的生物素标记,生物素标记效率高,可重复性好;体内或体外均可进行标记,标记后的蛋白与链霉亲和素(Streptavidin)的亲和力高,从而使Avi-tag技术可以应用于目的蛋白的固定吸附、纯化和检测等;相比于传统生物素化学标记的非特异性位点的标记,BirA催化的反应条件更温和、更简单,对被标记蛋白活力影响小,酶活效率高,标记特异性强。

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    6. 生物素化核苷酸及oligo

    生物素修饰的三磷酸核苷类似物,如 dUTP 和 dCTP,可以通过酶促整合到 DNA 或 RNA 片段中,用于荧光原位杂交 (FISH)、DNA 阵列、微阵列和其他杂交技术。标准酶促非放射性DNA标记反应,包括3'末端标记、cDNA 标记、切口平移、PCR和随机引物标记。每个生物素化核苷酸在生物素与其在核苷酸上的连接点之间包含一个 11、14、16 或 20 个原子的间隔区。例如常见的Biotin-dATP或Biotin-dCTP被用于HiC实验添加到酶切口处;生物素标记的linker(21bp dsDNA)可用于ChIAPET实验中连接两个染色质DNA片段;在RNA pull down实验中用生物素标记RNA(SP6或T7体外转录过程中,以Biotin-16-UTP部分取代UTP,从而转录生成生物素标记的RNA探针或mRNA。由于使用的RNA Polymerase对天然核苷酸(NTP)和生物素标记核苷酸(Biotin-NTP)没有选择倾向性,因此每个RNA转录产物生物素标记的程度可以通过调节转录反应中NTP与Biotin-NTP的比例来控制。一些试剂盒将Biotin-16-UTP的比例控制在约35%,使反应和标记效率之间达到较好的平衡。得到的生物素标记的RNA探针或mRNA可使用荧光基团、酶或抗体偶联的链霉亲和素(Streptavidin)进行检测,应用与RNA pulldown或其他富集实验。)逆转录反应中使用生物素修饰的引物合成带有生物素标记的cDNA;此外,RNA-seq文库构建中,生物素标记的Oligo(dT)与mRNA3''端的poly A退火形成杂交体,然后用带有链霉亲和素的顺磁磁珠洗涤并捕获杂交体,形成杂交体-磁珠复合体,最后用磁架将此复合体捕获;

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    7. 生物素化抗体

    做western blot或免疫组化时常使用一抗二抗来放大、显示抗原,用酶或荧光标记二抗。生物素化的抗体,是在抗体上连接生物素(biotin),生物素能和亲和素(avitin)特异性高亲和性结合,亲和力是抗原抗体结合的一万倍,而且一个avidin可以结合四个biotin,这样又起到级联放大的作用。所以能更加灵敏的显示微量抗原,这种方法也称亲和免疫组化。目前抗体蛋白标记技术已被广泛用于医学病理学、免疫组织化学、分子生物学、生物制药等领域的分析研究与技术测定,常见的抗体标记技术包括生物素化标记法,酶标记法,荧光素标记法和胶体金标记法。生物素化抗体标记的样品可应用酶标或荧光染料标记的亲和素或生物素-亲和素复合物来检测。生物素-SP是其6原子间隔位于生物素和其共轭的蛋白质之间。当生物素-SP结合抗体用于酶免疫测定时,与没有间隔的生物素结合抗体相比,灵敏度会提高。当生物素-SP共轭抗体与碱性磷酸酶共轭链维定一起使用时,这一点尤为明显。显然,长间隔将生物素部分从抗体表面延伸出去,使其更容易接触到链霉亲和素的结合位点。

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                                     生物素-SP分子。分子量454.54 Da。左22.4 Ä。

    图2. 标记链酶亲和素生物素法(LSAB)。A. 一抗体检测靶抗原。B. 生物素化二抗可识别一抗。C. HRP偶连链酶亲和素与生物素化的二抗体结合,与HRP偶联的二抗相比,能够显著增强信号。

    8. 如何从链霉亲和素磁珠上解离生物素化分子?

    链霉亲和素-生物素相互作用是已知的蛋白与其他分子间非共价的生物相互作用。生物素与链霉亲和素间的键形成非常迅速,一旦形成,就不会受到pH、温度、有机溶剂和其他变性剂等多种因素的影响。从链霉亲和素上分离生物素时,如果实验中使用的是生物素的衍生物或经修饰的链霉亲和素,那么需要特定形式和通常温和的方法解离,除此之外通常情况下都需要非常剧烈的方法解离,并且会使链霉亲和素变性。下面探讨了其中两种方法。

    生物素化核酸:为了从Dynabeads链霉亲和素磁珠上分离生物素化核酸,在pH 8.2的95%甲酰胺+10 mM EDTA中孵育磁珠,65°C孵育5分钟或90°C孵育2分钟。使用磁力架将磁珠吸到试管壁上,将含有生物素化核酸的上清液从试管中取出。有研究提到,在高温(120C,15分钟)下,才能在盐溶液中解离。另外,在6 mol/L盐酸胍溶液(pH 1.5)中也可解离;有研究指出,生物素标记的核酸探针不能用酚抽提,否则生物素核酸会进入酚层而损失;Holmberg等(Electrophoresis 26, 501-510, 2005)报道称,在用离子水短时间孵育后,可将生物素化DNA从链霉亲合素磁珠上释放(未进行测试)。

    生物素化蛋白质:对于生物素化蛋白质,则可在0.1% SDS或SDS-PAGE缓冲液中煮沸磁珠3分钟。

    9. 链霉亲和素磁珠结合片段的长度和结合能力为多少?

    于具有空间位阻,因此结合能力取决于片段大小。例如,500 bp片段在Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠上的结合量是1,000 bp片段的2倍。长DNA片段会占据磁珠周围更多空间,使其更难“找到"磁珠上的链霉亲和素。较短的片段更易接近链霉亲和素。对于大于2kb的DNA片段,推荐使用Dynabeads kilobaseBINDER™试剂盒。该试剂盒包括Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠和一种可增强长生物素化DNA片段(大于2kb)固定的结合液。对于大于1-2kb的DNA片段,推荐使用Dynabeads kilobaseBINDER™试剂盒,因为结合液可增强结合能力。该结合液可使DNA线性化,进而伸展且碱基堆叠成刚性结构(不适用于质粒或环状核酸等较短的片段)。

    盐浓度可影响生物素化核酸与Dynabeads链霉亲和素磁珠的结合效率。对于1kb以内的生物素化DNA片段,最佳结合条件为1M NaCl(终浓度),25℃孵育15分钟;较长的DNA片段应固定过夜。生物素化抗体应在含0.1% BSA,pH 7.4的PBS缓冲液中固定。由于游离生物素与Dynabeads链霉亲和素磁珠结合的速度比大分子更快,因此应确保样本不含过量的游离生物素。应使用HPLC或FPLC回收生物素化寡核苷酸,以避免样本中游离生物素的存在。由于待固定的特定分子的大小和生物素化过程都将影响磁珠的结合能力,因此,可采用滴定法优化每个单独应用中的磁珠使用量。

    10. Dynabeads链酶亲和素磁珠是无RNase的吗?

    Dynabeads链霉亲和素磁珠不是以无RNase溶液的形式提供的。处理RNA时,应使用DEPC处理的0.1M NaOH/0.05 M NaCl溶液清洗磁珠2次,每次1-3分钟。DEPC毒性很强。但能去除RNase。清洗后,可使用DEPC处理的0.1 MNaCl溶液重悬磁珠。"DEPC处理"是指:加入0.1% DEPC,混合,室温下解育1小时。随后,将DEPC处理的溶液进行高压灭菌,以破坏DEPC。

    11. 如何去除双链DNA中的非生物素化链?

    可通过碱处理或高温处理分离DNA双链。采取碱处理时,可使用0.1 M NaOH洗脱非生物素化链。通常情况下,该处理方法不会对磁珠产生任何影响。在NaOH处理前,在2X结合和洗涤缓冲液(10 mM Tris-HCl,pH 7.5,1 mM EDTA,2 M NaCl)中清洗Dynabeads/DNA复合物1次,除去上清液。高盐浓度将有助于减少电荷,从而使非特异性结合最小化。向Dynabeads/DNA复合物中加入新鲜配制(很重要)的0.1 M NaOH溶液,室温下旋转孵育2-3分钟(最多5分钟)。除去含有非生物素化链的上清液。再用0.1 M NaOH溶液清洗Dynabeads/DNA复合物1次,除去上清液。第一次洗脱时,即可洗脱下大部分DNA。除了碱处理,也可进行加热处理,在水中95°C加热5分钟即可。为防止再退火,碱处理或高温处理后必须快速从磁珠上分离DNA,最好在冰上操作。加热会在一定程度(在水中约为7%)上引起生物素化DNA从链霉亲和素上解离。因此,通常更推荐采用碱处理法。

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